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轉(zhuǎn)基因品系油菜45A37 PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟

更新時(shí)間:2025-07-25   點(diǎn)擊次數(shù):27次

轉(zhuǎn)基因品系油菜45A37 PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟:

    在完成PCR反應(yīng)體系的配制后,需將混合液短暫離心,確保所有組分集中于管底,避免氣泡干擾擴(kuò)增效率。隨后將PCR管置于預(yù)熱的擴(kuò)增儀中,設(shè)置程序:初始變性95℃ 5分鐘;后續(xù)循環(huán)階段為95℃ 30秒(變性)、58℃ 30秒(退火)、72℃ 45秒(延伸),共35個(gè)循環(huán);最終延伸72℃ 7分鐘。程序結(jié)束后,立即取出樣品,避免長(zhǎng)時(shí)間高溫導(dǎo)致產(chǎn)物降解。

   為驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果,需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。制備1.5%瓊脂糖凝膠(含核酸染料),取5μL PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后點(diǎn)樣,同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)記物作為參照。電泳條件為100V 30分鐘,紫外凝膠成像儀下觀察條帶。若目標(biāo)條帶清晰且大小與預(yù)期一致(如45A37品系特異的200bp片段),則表明檢測(cè)有效;若出現(xiàn)非特異性條帶或假陰性,需排查模板純度、引物特異性或反應(yīng)體系污染問(wèn)題。

  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,需對(duì)數(shù)據(jù)嚴(yán)格記錄,包括擴(kuò)增曲線Ct值、電泳圖譜及異常現(xiàn)象。若檢測(cè)樣本為農(nóng)產(chǎn)品或環(huán)境樣品,建議設(shè)置三重重復(fù)以排除操作誤差,并通過(guò)陰性對(duì)照(無(wú)模板對(duì)照)和陽(yáng)性對(duì)照(已知轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品)確保結(jié)果可靠性。最后,所有耗材需按生物安全規(guī)范處理,避免交叉污染影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

   注意事項(xiàng):退火溫度可根據(jù)引物Tm值微調(diào);若擴(kuò)增效率低,可嘗試梯度PCR優(yōu)化條件;電泳時(shí)需確保凝膠濃度與目標(biāo)片段大小匹配。此方法適用于快速篩查,但若需定量分析,建議采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。


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